ELISA试剂盒技术支持操作注意事项

 芬德生物-专业讲解ELISA试剂盒技术

注：在样本处理过程中，一定按照说明书步骤进行，样本混匀充分、取液体量、离心时间和转速非常重要

没有去离子水或双蒸水时，可以使用娃哈哈纯净水配制溶液，切勿使用自来水

一、操作常遇问题

1.样品稀释：酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。我公司产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2.试剂盒平衡：试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃)，一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒打开盒盖置37℃温箱20分钟。稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

3.加样：尽量操作规范，将液体垂直悬空快速加入到微孔板中，避免加到孔避上。加完试剂后用手适当振荡或在桌面适当作圆周运动，使孔内试剂充分混匀，盖好盖板膜。

4.洗板：洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置10-15s，甩去板孔中洗液后，一定要用力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。

二、概念及试剂盒相关问题：

1、灵敏度：指应用该法能检出待测抗原的最低量，即最小检出量。

2、精密度：又称可重复性，反映测定方法对某一特定样本多次测定所得结果的重复程度。

3、准确度：某种方法测定结果接近真实值的程度，常用回收率来表示。60%以上的回收率均可接受。（60% ~120%）

4、 特异性：指某种测定方法对被测物质的专一程度，一般用抗体交叉反应表示。

5、稳定性：指任何测定条件下，该方法测定结果的一致程度。（实际准确性和精密度都能反应稳定性）。
6、中值（Ic50）：产生50%抑制率（B/B0）所需的半抗原量。

7、检测限：（LOD）指分析方法能够从样品的背景信号中检测出待测物存在时所需要的最低浓度，

8、定量限：（LOQ）指分析方法能够对样品中待测物进行定量测定的最低浓度。反应了方法在低浓度端分析结果的可靠性，一般为CV≦20%，回收率≧70%。

9 、 注：

     （1）样本中存在的类风湿因子（RF）能引起非特异性反应，这些自身抗体可与IgG发生特异性免疫反应，从而出现假阳性反应  。  

      （2）引起平行性不好的因数：①酶标板本身变异系数大 ②实验人员操作本身的准确性（如：加样、洗板等等）。
      （3）曲线相关系数不好：实验操作因数基多，洗板非常关键。